גנטיקה, חלבונים ואוטיזם

מה קורה כאשר מוטציה גנטית משנה את רשת הקשרים של החלבונים וכיצד זה קשור להתפתחות אוטיזם?

כיצד יתכן שמאות גנים שונים, שכל אחד מהם מכיל הוראות ייצור לחלבון אחר לחלוטין, יכולים להיות קשורים כולם לאותה אבחנה קלינית של אוטיזם?

זוהי אחת החידות המורכבות ביותר בחקר ההתפתחות העצבית. במשך שנים, עיקר המאמץ המדעי התמקד באיתור עוד ועוד גנים הקשורים לסיכון לאוטיזם, מתוך תקווה שרשימה הולכת ומתארכת תספק את התשובה.

מחקר חדש ומקיף, שפורסם בכתב העת Science, מציע שינוי תפיסתי עמוק ומעניין במיוחד.

לפי תוצאות המחקר, הפתרון אינו מסתתר רק בזהות הגנים עצמם, אלא ברשת הקשרים המסועפת שהחלבונים שלהם יוצרים בתוך התא. במקום להסתכל על רשימת גנים, החוקרים שרטטו מפה מפורטת של מגעים מולקולריים, המדגימה כיצד שינויים גנטיים שונים מתכנסים ומשבשים צמתים משותפים במוח המתפתח.

מהו חלבון ומהי שפת הרשתות?

כדי להבין את פריצת הדרך המחשבתית של המחקר, יש להבין תחילה את מילון המונחים הבסיסי של התא.

גן הוא למעשה מקטע של DNA המכיל הוראות לייצור חלבון. החלבונים הם הפועלים של התא, המולקולות שמבצעות את רוב התהליכים הביולוגיים בגוף שלנו.

מוטציה גנטית או וריאנט מקודד, היא שגיאת כתיב קטנה ברצף ה־DNA, אשר יכולה לגרום לייצור חלבון משובש, השונה בצורתו ובתפקודו.

החלבונים כמעט לעולם אינם פועלים לבדם. הם חוברים זה לזה ויוצרים אינטראקציות המכונה Protein-Protein Interactions או בקיצור PPI, המתגבשות לכדי מבנים חלבוניים, מעין מכונות זעירות המורכבות מכמה חלבונים שפועלים יחד.

כאשר חוקרים רוצים להבין מה חלבון מסוים עושה, לא מספיק לשאול האם הוא קיים?, אלא יש לבדוק עם מי הוא מדבר?.

המחקר הנוכחי אינו מסתפק בשאלה האם חלבוני הסיכון קיימים, אלא ממפה בשיטתיות את שותפיהם ובוחן האם המוטציות משנות את מערכות היחסים המתגבשות במסגרת ה-PPI.

מפת הדרכים המולקולרית במספרים

היקפו של המחקר מרשים במיוחד, כשהחוקרים יצאו לדרך עם ידע מוקדם על יותר מ־250 גני סיכון לאוטיזם בעלי ביטחון גבוה.

מתוכם, הם בחרו 100 חלבונים / גנים בעלי ביטחון גבוה כדי למפות את רשת הקשרים שלהם – מדובר בגנים שהראיות הגנטיות הקיימות קושרות אותם בסבירות גבוהה יחסית לסיכון לאוטיזם, ולא ברשימה כללית של כל גן שנמצא אי פעם קשור לאוטיזם.

התוצאה היא רשת ענפה הכוללת 1,881 אינטראקציות בסך הכול, שקשרו את 100 חלבוני הסיכון ל־1,074 חלבונים ייחודיים אחרים המכונים אינטראקטורים.

נתון מדהים הוא ש־87% מהאינטראקציות הללו לא דווחו קודם לכן בספרות המדעית, מה שמרחיב דרמטית את הבנתנו על הסביבה המולקולרית של האוטיזם. החוקרים מצאו חציון של 11 אינטראקטורים לכל חלבון סיכון.

בשלב השני, כדי להבין מה קורה במצב של מחלה, החוקרים בחנו 54 וריאנטים פתוגניים מסוג missense, שינוי של חומצת אמינו בודדת, שנלקחו ממטופלים, ואשר פגעו ב־30 מתוך אותם גני סיכון.

לדוג חלבונים: כיצד משרטטים מפה?

כדי לגלות בין החלבונים, מי קשור למי, החוקרים השתמשו בטכניקה המכונה בשפה המקצועית AP-MS או בשמה המלא Affinity purification–mass spectrometry.

בשיטה זו, מצמידים תג מולקולרי לחלבון המטרה, כמו פיתיון על חכה, מושכים אותו מתוך התא, ובאמצעות ספקטרומטר מסות מזהים גם את כל החלבונים האחרים שנקשרו אליו ועלו בחכה.

המיפוי רחב ההיקף הזה בוצע בתאי HEK293T, שהם תאי כליה אנושיים המגודלים במעבדה.

השימוש בתאים אלו מאפשר ביצוע ניסויים בקנה מידה עצום, לעומק, וברמת שחזור גבוהה, תנאים הכרחיים ליצירת מפה אמינה של אלפי חלבונים.

עם זאת, תא כליה בצלחת פטרי במעבדה אינו מוח מתפתח. כדי להתמודד עם מגבלה מתודולוגית זו, החוקרים העבירו את הממצאים המרכזיים שלהם למסלול אימות קפדני במערכות ביולוגיות רלוונטיות הרבה יותר.

מחיזוי ממוחשב ועד למוח מיניאטורי

המחקר הנוכחי אינו מסתמך על מודל אחד, אלא נע בין רמות שונות של ראיות ביולוגיות.

לאחר המיפוי הראשוני ב־HEK293T, החוקרים נעזרו במערכת הבינה המלאכותית AlphaFold-Multimer כדי לנתח את המבנה התלת־ממדי של האינטראקציות.

משם, הם עברו לבדיקות בתאים קודמניים עצביים שמקורם בתאי גזע מושרים של אדם iPSC, המשיכו לניסויים בבעל חיים מסוג צפרדע העץ, וקינחו באורגנואידים של המוח הקדמי האנושי, שהם מודלים תלת־ממדיים של רקמה עצבית המתפתחים במעבדה.

העובדה שממצאים מסוימים חזרו על עצמם לאורך כל שרשרת המערכות הללו מעניקה משנה תוקף למסקנות המחקר, ועדיין חשוב לזכור כי מדובר במודלים מחקריים ולא במוח אנושי של אדם חי.

חשוב להבהיר כי הבינה המלאכותית לא שימשה במחקר כדי למצוא גנים שגורמים לאוטיזם. תפקידו של AlphaFold היה לעזור לחוקרים להבין אילו מבין האינטראקציות שנמצאו הן כנראה מגע פיזי וישיר בין שני חלבונים, ולזהות את אזורי המגע המדויקים ביניהם.

הניתוח זיהה 113 אינטראקציות ישירות בסבירות גבוהה, ש־49 מתוכן לא היו מוכרות קודם לכן למדע!

הניתוח הממוחשב לווה בבקרת איכות שניבאה שיעור גילויים שגויים FDR של 10–20%. כדי לוודא את יעילות המודל, החוקרים בדקו 37 זוגות של חלבונים באמצעות מבחן ביולוגי בשם NanoLuc, ואימתו 12 מתוכם. נתונים אלו מבהירים כי למרות שהחיזוי המבני הוא כלי עזר רב־עוצמה, הוא נותר בגדר מודל הסתברותי שאינו מחליף אימות בניסוי ביולוגי ממשי.

המוקד: תאים בתחילת ההתפתחות

אחת השאלות המרכזיות בחקר האוטיזם היא היכן במוח, ומתי במהלך ההתפתחות, התהליך מתחיל להשתנות.

כאשר החוקרים הסתכלו על רשת האינטראקציות השלמה, התקבלה תמונה ברורה. ההתכנסות המולקולרית בלטה במיוחד בסביבתם של תאים קודמניים עצביים, ובעיקר בשושלת של התאים האקסיטטוריים, שהם נוירונים מעוררים, המהווים את בסיס התקשורת במוח.

תאים קודמניים הם למעשה תאי אב שמתחלקים ויוצרים את הנוירונים שירכיבו את קליפת המוח.

בעוד שמחקרים גנטיים קודמים הצביעו פעמים רבות על נוירונים בשלים כמקור להפרעה, התמונה שעלתה ממפת החלבונים החדשה משכה את תשומת הלב שלב אחד אחורה בזמן, אל השלבים המוקדמים של יצירת הנוירונים האקסיטטוריים.

כשהמולקולות נפגשות בצומת DCAF7

דוגמה בולטת להתכנסות של חלבוני סיכון אל מבנה משותף במצב הבריא, מגיעה מחלבון בשם DCAF7.

חלבון זה זוהה במחקר כצומת מרכזי ברשת. המשמעות של צומת כזה היא שיותר משמונה חלבוני סיכון שונים לאוטיזם נקשרים אליו, מה שהופך אותו לנקודת מפגש מרכזית ברשת החלבונית.

החוקרים גילו כי DCAF7 יוצר קומפלקס ספציפי עם חלבון סיכון מוכר בשם DYRK1A ועם חלבון נוסף בשם KIAA0232.

כדי לבחון את תפקידו, השתמשו החוקרים במערכת עריכה גנטית מסוג CRISPR בעוברי צפרדעים מזן Xenopus.

הם מצאו כי פגיעה ב־DCAF7 או ב־KIAA0232 חיקתה פנוטיפ התפתחותי שנצפה בעקבות פגיעה ב־DYRK1A, בדמות הקטנה של הטלנצפלון, האזור שיתפתח להיות המוח הגדול.

במקביל, ניסויים בתאים קודמניים עצביים אנושיים הראו שפגיעה במבנה זה משבשת את יכולתם של התאים להתרבות, ומפחיתה את רמות הביטוי של גורמי שעתוק מרכזיים החיוניים להתפתחות המוח, כגון PAX6, FOXG1 ו־SOX2.

חשוב להדגיש כי ממצאים אלו מציגים מנגנון ביולוגי מרתק, אך הם אינם קובעים כי DCAF7 הוא הגורם היחיד לאוטיזם, או שכל אדם אוטיסט סובל בהכרח מפגיעה במסלול הספציפי הזה.

המוטציה משנה את הכללים

אחד החידושים המרכזיים של המחקר טמון בהבנה שמוטציה פתוגנית אינה גורמת בהכרח לחלבון פשוט להיעלם או לאבד תפקוד לחלוטין.

לעיתים קרובות, המוטציה הגנטית מובילה לתהליך של חיווט מחדש של האינטראקציות בתהליך שמכונה PPI rewiring. כלומר, החלבון הפגום יכול לאבד קשר עם שותף ותיק, ליצור קשר חזק יותר, או אפילו להתחיל לתקשר עם חלבונים חדשים שאינם שייכים לרשת המקורית שלו.

במיפוי הרשת המוטנטית, החוקרים זיהו 253 אינטראקציות שהשתנו באופן מובהק בהשוואה לחלבונים התקינים ומתוכן, 136 היו אינטראקציות שנחלשו או אבדו לחלוטין.

ממצא קריטי נוסף להבנת עקרון ההתכנסות הראה כי בקרב 13 חלבוני סיכון, שבהם נבדקו כמה וריאנטים שונים באותו גן, ב־45% מהאינטראקציות שהשתנו, השינוי חזר על עצמו בשני מוטנטים או יותר.

משמעות הדבר היא שמוטציות שונות באותו חלבון עשויות להוביל לאותה תקלה בדיוק ברשת התקשורת של התא.

הסיפור של FOXP1 ו־FOXP4

הדוגמה המרשימה ביותר במחקר למסלול שלם, החל ממוטציה נקודתית, דרך שינוי באינטראקציה בין חלבונים ועד לשינוי בפעילות חשמלית של תאים, קשורה לחלבון המוכר FOXP1.

חלבון זה מתפקד כגורם שעתוק, חלבון הנקשר ל־DNA ושולט בביטוי של גנים אחרים, וידוע כי הוא חובר לחלבון אחר בשם FOXP4 כדי לבצע את תפקידו.

החוקרים מצאו כי וריאנטים שונים ב־FOXP1 החלישו משמעותית את האינטראקציה הפיזית שלו עם FOXP4. הנתונים מצביעים על כך שבתנאי הביקורת התקינים, הייתה חפיפה של 94.7% בין האתרים שבהם FOXP4 קשור ל־DNA לבין האתרים שבהם FOXP1 קשור אליו.

לעומת זאת, באורגנואידים נושאי המוטציה, החפיפה צנחה ל־67.4% בלבד. כתוצאה מהניתוק, נצפו כ־4,700 אתרים חדשים לחלוטין שאליהם FOXP4 נקשר בגנום המוטנטי, אתרים שלא הופיעו כלל בתנאי הביקורת התקינים.

הפיזור מחדש הזה של FOXP4 על פני ה־DNA נקשר להבשלה מוקדמת מדי של נוירונים קורטיקליים – בתאי קליפת המוח.

החוקרים עקבו אחר סמנים ספציפיים וזיהו שינויים באוכלוסיות התאים. נצפתה ירידה בתאים המבטאים PAX6, ועלייה בתאים המבטאים BCL11B ו־TBR1, המייצגים שלבי הבשלה מתקדמים יותר של הנוירונים.

בסופו של דבר, השינוי המבני הוביל לשינוי פיזיולוגי, כאשר באורגנואידים המוטנטיים נרשמה עלייה בקצב הירי הממוצע של הפעילות החשמלית. עם זאת, חשוב לדייק מדעית ולציין כי לגבי תאי TBR1, נרשמה אמנם ירידה ביום ה־101 באורגנואידים המוטנטיים, אך היא לא הגיעה לרמת מובהקות סטטיסטית לאחר תיקון להשוואות מרובות.

כשהסרת החלבון מתקנת את המצב

אחד הניסויים המסקרנים ביותר התרחש כאשר החוקרים החליטו להנדס גנטית את האורגנואיד המוטנטי, וביטלו לחלוטין את פעילותו של החלבון השותף, FOXP4 בתהליך שמכונה knockout.

באופן מפתיע, פעולה זו החזירה את התפתחות הנוירונים לדפוס קרוב יותר לזה של תנאי הביקורת.

ניסוי זה משמעותי במיוחד משום שהוא מרמז שהבעיה באורגנואידים אלו לא נבעה רק מאובדן תפקוד של FOXP1 בשל המוטציה, אלא מכך שהפגיעה גרמה ל־FOXP4 לרכוש דפוס פעולה שונה, ובפרט להיקשר לאתרים גנומיים שאליהם לא נקשר בתנאים התקינים.

על אף שהחוקרים מציינים במפורש כי המנגנון המדויק שבאמצעותו פועל התיקון הזה עדיין דורש בירור מעמיק, הניסוי פותח אופק למחשבה טיפולית שונה ומרתקת במיוחד.

חשוב להדגיש כי אין מדובר בהוכחה לכך שניתן כיום "לתקן" אוטיזם בבני אדם באמצעות חסימת החלבון FOXP4.

כדי לבחון האם השינויים בהתפתחות התאים ייחודיים ל־FOXP1, החוקרים הכניסו וריאנט פתוגני אחר (E198K) לגן בשם PPP2R5D.

גם בניסוי זה באורגנואידים, נצפה דפוס דומה הקשור לתהליך הנוירוגנזה המוקדמת. ירידה בתאים המבטאים PAX6 ועלייה בתאים המבטאים BCL11B.

הממצא מחזק את הרעיון הרחב של המחקר, המציע כי מוטציות בגנים שונים לחלוטין עשויות להוביל לתהליכים דומים של שיבוש בתזמון ובהתפתחות קליפת המוח.

המשמעות הגנטית הגדולה

ברמה הגנטית, המחקר ממחיש מדוע רשימה ארוכה של גני סיכון אינה מספקת. כעת אנו מבינים שהגנים הם רק נקודת ההתחלה, וכי השפעתם נקבעת בסביבה המולקולרית שלהם.

ברמה הביולוגית, המחקר מזהה רשתות ומבנים שאליהם מתכנסים גנים שונים, ומראה שמוטציות באותם גנים גורמות לנזק בכך שהן משנות את חיווט הרשתות הללו.

ברמת הרפואה העתידית, התובנות מעלות אפשרות חדשה. אם מורכבות התפתחותית נובעת לעיתים משיבוש של מגע פיזי בין שני חלבונים, יתכן שבעתיד נוכל לחשוב על טיפולים שמכוונים לתקן או לאזן את הממשקים והצמתים המולקולריים הללו, ולא רק לנסות לתקן את הגן הספציפי שנפגע.

עם זאת, חובה להבחין בין כיוון טיפולי אפשרי שזוהה במעבדה, לבין תרופה לאוטיזם. המחקר אינו מציג ניסוי קליני, אלא מסגרת מדעית עמוקה שנדרשות עוד שנים של פיתוח כדי לתרגמה לפרקטיקה קלינית.

הורים לילדים עם ממצא גנטי?

עבור הורים שילדיהם עברו בדיקה גנטית לאחר אבחון אוטיזם ובידיהם דוח גנטי המצביע על וריאנט ספציפי, המחקר אינו מאפשר כיום להסיק פרוגנוזה אישית לגבי ילד מסוים.

הוא מסביר מדוע המשמעות של הממצא הגנטי תלויה לא רק בשם הגן, אלא בסוג המדויק של המוטציה, במיקומה הפיזי המדוייק על פני החלבון, ובאופן שבו היא משפיעה על המגעים של אותו חלבון עם סביבתו.

המחקר אינו מאפשר כיום לקחת וריאנט גנטי של ילד מסוים, להזין אותו למחשב, ולהסיק באופן אוטומטי מהי דרך הטיפול או את המהלך הצפוי של ההתפתחות הקוגניטיבית של הילד.

עם זאת, המחקר בהחלט מעניק מסגרת מחשבתית חדשה שמבהירה כי ילדים עם מוטציות בגנים שונים לחלוטין עשויים לחלוק מנגנונים ביולוגיים משותפים.

גבולות המדע ומבט לעתיד

ראוי לזכור כי המדע נבנה נדבך על נדבך, ולכל מתודולוגיה יש מגבלות. חלק ניכר מהמיפוי הראשוני של אינטראקציות החלבונים בוצע ב־HEK293T, תאי כליה במעבדה, שאינם מוח אנושי חי.

אינטראקציות מולקולריות הנצפות בתנאי מבחנה או בתאים מסוימים אינן מתרחשות בהכרח באותה עוצמה או צורה בכל תא במוח ובכל שלב התפתחותי.

בנוסף, מודל AlphaFold מספק תחזיות מבניות חכמות במיוחד, אך הן נותרות בגדר הסתברויות שרק חלק קטן מהן נבדק בפועל בשיטות ניסוייות מובהקות.

כמו כן, המחקר התמקד ב־54 מוטציות גנטיות ספציפיות בלבד. המוטציות שנבחרו מייצגות קבוצה של וריאנטים פתוגניים קשים במיוחד, ולכן אין להכליל אוטומטית את התוצאות לכלל הספקטרום הרחב של גנטיקה באוטיזם.

למרות שהמחקר השתמש במודלים ביולוגיים מתקדמים כמו אורגנואידים של המוח ועוברי צפרדעים, אלו הם עדיין מודלים, שאינם יכולים לייצג בשלמות את המוח האנושי המורכב השלם.

המחקר אינו מאשר כמה דברים שחשוב להדגיש:

• הוא אינו אומר שמצאנו את הגן של האוטיזם.
• הוא אינו אומר שכל האנשים האוטיסטים חולקים מנגנון ביולוגי זהה לחלוטין.
• הוא אינו קובע שכל מוטציה באחד מהגנים שנחקרו תוביל לאותו פנוטיפ או תסמינים.
• הוא אינו אומר שניתן כיום לגשת לבית המרקחת או למעבדה ולתקן את המוטציות באמצעות תרופה.
• הוא אינו מוכיח שטיפול מכוון באחד המבנים החלבוניים ישפר תסמיני אוטיזם באנשים בוגרים.
• הוא אינו הופך מידע שעלה בבדיקת אקסום לאבחנה ברורה של מסלול התפתחותי עתידי.

פריצת הדרך האמיתית של המחקר המרתק הזה מתבטאת בשאלה החדשה שהוא מציב. אחת הנקודות החשובות ביותר בגנטיקה של ההתפתחות העצבית אינה מסתכמת עוד בשאלה איזה גן נפגע? אלא מתרחבת לכדי ההבנה שהשאלה המדוייקת יותר היא מה עושה המוטציה הגנטית לרשת המולקולרית שהחלבון הוא חלק ממנה?

המעבר מדיון על גנים בודדים לניתוח של ביולוגיה של רשתות חלבונים וחיווט מחדש מסמן כיוון מבטיח בניסיון לפצח כיצד שינויים גנטיים מגוונים מתכנסים בסופו של דבר לכדי מסלולים פתולוגיים דומים בהתפתחות המוח.

המפה שנוצרה כאן היא צעד משמעותי בהבנת המנגנונים המולקולריים המקשרים בין וריאנטים גנטיים להתפתחות עצבית.

היא אינה מפה קלינית המאפשרת לחזות את עתידו של ילד או לרשום לו טיפול היום, אך היא ללא ספק מתווה את תוואי השטח שעליו תצעד רפואת העתיד.

קריאה נוספת: מדד EAGLE מדרג גני סיכון לאוטיזם